实验步骤

1. 蛋白质双向电泳

    1) 第一向固相pH梯度等电聚焦电泳

        a. 上样：第一向等电聚焦采用胶内加样的方法进行。精确吸取一定量的蛋白样品(银染样品的蛋白上样量为140 ug计，考染样品为1.3 mg)加入重泡涨液(8 mol/L尿素，2%CHAPS，痕量滨酚蓝，20 mmol/L DTT，0.5 % IPG buffer)，使终体积达到350ul。混匀后均匀加在IPG胶条holder的正、负极之间。将预制IPG胶条(pH 3 -10 NL)除去保护膜，胶面向下，覆于holder中的样品之上；慢慢下压胶条，并前后移动，避免生成气泡。在胶条上方均匀封以1 ml覆盖油，盖上盖子。

        b. 等电聚焦：将装有样品和IPG胶条的strip holder置一向电泳仪(IPGphorTM Isoelectric Focusing System)上进行等电聚焦。等电聚焦参数：0V电压下泡涨3h，30V电压下泡涨10 h，500 V电压下电泳0.5 h，2000V电压下电泳0.5 h，5000 V电压下电泳0.5 h，8000 V电压下电压20 h。

        c. 胶条的平衡：第一向电泳结束后，取出IPG胶条平衡两次，每次15 min。平衡缓冲液(50 mol/L Tris buffer pH 8.8，6 mol/L尿素，30甘油，0.8 g澳酚蓝，20 mmol/L DTT，含2 % (w/v) SDS)可减少电内渗，有利于蛋白质从第一向转移到第二向。在第二步平衡中用100mmol/L碘乙酞胺代替DTT以除去第一步平衡时的DTT。平衡后的IPG胶条沿边缘用滤纸吸去多余的平衡液。

    2) 第二向垂直SDS-PAGE

根据IPG conversion Kit的体积，配制大小为200 mmX200 mmX 1mm，浓度为12.5%T，3.3%C的均匀胶。将平衡好的IPG胶条移至凝胶上方，用0.5%琼脂糖电泳缓冲液封闭。电泳的缓冲液系统为Tris-Glycine-SDS系统(500 ml，SX，7.5 g Tris，2.5 g SDS，36 g Glycine)。一向胶条和二向胶接触面避免气泡产生；封胶温度不能过高，封胶时不要引入气泡。

电泳参数设置：14-15℃恒温下，以每胶条计

20 mA恒流电泳40 min

30 mA恒流电泳至澳酚蓝电泳到底部。

2. 染色

    1) 银染法：将二向电泳完成后的SDS-PAGE转移至固定液(40%无水乙醇，10%冰醋酸)中，固定30 min；弃固定液换敏化液(30%无水乙醇，6.8%醋酸钠，0.2%硫代硫酸钠，0.5%戊二醛)敏化30 min；弃敏化液，以双蒸水200 ml洗2次，每次30 min；之后置于银染液((0.25%硝酸银，40%甲醛)染色20 min，染色时避光；弃银染液，以双蒸水200ml洗2次，每次1 min；显色液((2.5%碳酸钠，20%甲醛)显色2-5 min，至蛋白质点完全显现为止；弃显色剂，立即换终止液(1.46 %EDTA)，终止显色10 min；以超纯水洗3次，每次5 min。

    2) 考马斯亮蓝染色(考染)法：将二向电泳完成后的SDS-PAGE转移至固定液(50%无水乙醇，10%冰醋酸的水溶液)中，固定30 min以上；弃固定液，加入染色液(10%冰醋酸，G-350过滤所得)，热染10 min；之后转移至脱色液中(10%冰醋酸水溶液)过夜，直至背景色脱尽；超纯水清洗。

3. 图像分析

以ImageScanner光学扫描仪在256色和300 dpi分辨率下对凝胶进行扫描。以Image Master 2D Elite 3.01分析软件完成图像分析。

4. 肽质量指纹谱(Peptide mass fingerprinting，PMT)分析样品制备

    1) 脱色：选取2D胶上目的蛋白斑点，用干净解剖刀片沿染色边缘切下蛋白点，并切成1-2 mm大小的胶片，另切一块无蛋白的2D胶作空白对照，用水清洗几次后用含50%乙睛，25 mmol/I，NH₄CO₃溶液振摇20 min，弃去溶液，重复1-2遍至胶片中的蓝色褪尽。

    2) 酶切：将胶片真空离心干燥20 min，使其完全脱水体积缩小，胰蛋白酶用25 mmol/L NH₄CO₃溶液配成0.01ug/ul，加入10ul于各样品管中，4℃冰箱中放置30 min，待酶液完全被吸收，37℃保温反应(封口)12 h。

    3) 肽提取：加5 % TFA(三氟醋酸)溶液120 ul于40℃保温1h，吸出上清液，加2.5%TFA，50%ACN(乙睛)溶液120 ul于30^oC保温1h，吸出上清液，合并上清液，冰冻干燥。

5. 差异蛋白质的肽质量指纹谱分析

冻干后用10ul0.5%TFA溶解肤混合物或脱盐后的提取液，用Bruker公司的质谱仪REFLEX III基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱(Matrix  assisted  laser  desorption/ionization  time  of  flight  massspectrometry，MALDI-TOF-MS)进行分析。取1ul点靶，另取1ul a-氰基-4-经基肉桂酸溶于0.1 % TFA/50 % ACN的饱和溶液作基质，室温干燥。质谱仪采用激光波长337 nm，反射检测。

6. 数据库检索初步鉴定蛋白质

数据库检索程序根据输入的蛋白质等电点、分子量范围及肤指纹谱数据和其它一些参数在数据库中寻找与这些参数相匹配的蛋白质。检索数据库程序为：http://www.matrixscience.com