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细菌的革兰氏染色和特殊形态观察
更新时间:2015-08-27

 

实验原理

 

染色方法:
革兰染色法是细菌学中最广泛使用的一种鉴别染色法。1884 年 由丹麦医师 Gram 创立。方法是先将细菌用结晶紫染色,加媒染剂(增加染料和 细胞的亲和力)后,用脱色剂(酒精或丙酮)脱色,再用复染剂染色。如果细菌 不被脱色而保存原染液颜色者为革兰阳性菌(G+);如被脱色,而染上复染液的颜 色者为革兰阴性菌(G-)。此染色法可将所有具有细胞壁的细菌分为两大类:革兰 阳性菌和革兰阴性菌。

单染色法:只能观察微生物的大小、形状、和细胞排列状况,但不能鉴别微生物以及它的特殊构造等。
复染色法:用两种或两种以上染色液进行染色,有协助鉴别微生物的作用,故也称鉴别染色法。常用的有: 革兰氏染色法、抗酸染色法、芽孢染色法、鞭毛染色法等。

染色原理: 现在认为细菌对革兰染色的不同反应主要是革兰阳性菌和阴性菌 的细胞壁结构与化学组成不同。革兰阳性菌的细胞壁较厚,肽聚糖含量多,且交 联度大,脂类含量少,经 95%乙醇脱色时,肽聚糖层的孔径变小,通透性降低, 与细胞结合的结晶紫与碘的复合物不易被脱掉,因此细胞仍保留初染时的颜色。 而革兰阴性菌的细胞壁较薄,含有较多的类脂质,而肽聚糖的含量较少,乙醇脱 色时溶解外层类脂质,增加了细胞壁的通透性,使初染的结晶紫和碘的复合物易 于渗出,结果细胞被脱色,经复染后,又染上复染的颜色。

 

实验试剂

 

革兰氏染色液一套 
结晶紫
碘液
95%乙醇
番红花红
孔雀绿

 

实验设备

 

显微镜
盖玻片
载玻片

 

实验材料

 

菌种:大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌

 

实验步骤

 

1. 革兰氏染色 
  (1)涂片
  (2)初染:在做好的涂面上滴加草酸铵结晶紫染液,染1分钟,倾去染液,流水冲洗至无紫色。
  (3)媒染:先用新配的路哥氏碘液冲去残水,而后用其覆盖涂面1分钟,后水洗。
  (4)脱色:除去残水后,滴加95%酒精进行脱色约15-20秒,后立即用流水冲洗。
  (5)复染:滴加番红染色液,染3-5分钟,水洗后用吸水纸吸干。 
  (6)镜检:观察染色结果并绘图。

2. 染色过程:涂片(大肠杆菌和金黄色葡萄球菌)→干燥→固定→初染(结晶 染色过程: 紫染色 1min)→媒染(碘 1min)→水洗→95%乙醇脱色(1min)→复染(番红花 红染色 1min)→干燥→镜检(油镜)

3. 油镜的使用与保养
  (1)在需观察部位的玻片上滴加一滴香柏油,然后慢慢转动油镜,在转 换油镜时,从侧面水平注视镜头与玻片的距离,使镜头浸入油中而 又不以压破载玻片为宜。 
  (2)用双眼观察目镜,并慢慢转动粗调节器至出现模糊物象,然后用细 调节器至物象清晰为止。 
  (3)如果不出现物象或者目标不理想要重找。 
  (4)油镜使用完毕,先用擦镜纸沾少许乙醇将镜头上和标本上的香柏油 擦去,然后再用干擦镜纸擦干净。

 

注意事项

 

1. 菌种应选用对数期的菌种; 
2. 涂片不易过厚,涂片薄而均匀为好; 
3. 脱色不足或脱色过度均会造成革兰染色的假阳性或假阴性,脱色时间 取决于涂片厚度、室温等;
4. 实验结束 请确保油镜头擦拭干净。

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